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2017-06-05 10:23:49 來源: 上海生命科學研究院 作者:
5月19日，《細胞研究》期刊在線發表瞭題為《運用CRISPR/Cas9技術實現以同源臂介導的末端接合為基礎的靶向整合》的研究論文，該研究由中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心楊輝研究組、基因編輯平臺施霖宇團隊與蘇州非人靈長類研究平臺孫強團隊合作完成。該研究設計瞭一種以同源臂介導的末端接合（Homology-Mediated End Joining, HMEJ）為基礎的基因敲入策略，它在很多種系統（體外培養的細胞、動物胚胎和體內組織）中比現有的基因敲入策略的效率都要高。基於更高效的編輯效率和更好的精確度，HMEJ介導的基因敲入方法為一系列應用，包括基因編輯動物模型的建立、疾病的靶向基因治療等提供瞭非常大的應用前景。
在臨床治療應用方面，精確的靶向基因組編輯是非常重要的。規律成簇的間隔短回文重復（CRISPR）/CRISPR相關蛋白-9核酸酶（Cas9）系統通過在基因組上靶向形成DNA雙鏈斷裂（DSB）的方式極大地促進瞭轉基因的靶向整合。一旦產生一個DSB，靶向整合可以通過多種策略來實現，包括同源重組（HR）、微同源臂介導的末端接合（MMEJ）或者非同源末端接合（NHEJ）。
常用的同源重組（HR）策略介導的基因靶向整合在動物胚胎和組織中效率低下。而且NHEJ介導的修復系統會導致隨機方向的整合，以及在接合處引入各種形式的插入、刪除或突變，使得這種方法難以通過同框整合的方式形成內外源融合基因以形成嵌合蛋白。即使是之前報道的MMEJ策略，也隻能在某些系統內提高效率。因此，研究者們試圖探究是否存在一種在多個系統內都可以有更高效的編輯效率和更好的精確度的基因靶向整合策略。
在本工作中，研究團隊基於CRISPR/Cas9系統，設計瞭一種新的以HMEJ為基礎的靶向精確整合策略，即利用帶有單個向導RNA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約800bp）的供體載體來實現高效的精確整合。
為瞭驗證這一想法，研究團隊構建瞭四種類型的供體載體來比較敲入效率：HMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在800bp長度的同源臂兩端）、HR供體（隻有800bp長度的同源臂）、NHEJ供體（隻有sgRNA靶向位置序列）以及MMEJ供體（sgRNA靶向位置序列加在20bp的微同源臂兩端）（圖A）。然後將這四種系統分別在體外培養的細胞系、小鼠和猴胚胎以及成體組織上進行效率比較。
研究者發現在體外培養的小鼠ES細胞和N2a細胞中，HMEJ為基礎的定向整合效率與HR方法相比較並無顯著提高。然而，在原代星形膠質細胞和神經元細胞中，HMEJ方法具有很高的DNA敲入效率。更重要的是，在小鼠和猴子胚胎中展現瞭非常強大的基因敲入能力（圖B）。此外，通過尾靜脈水動力註射法感染成體小鼠的肝細胞，發現HMEJ介導的基因敲入效率遠高於以HR、NHEJ和MMEJ為基礎的策略（圖C D）。采用AAV定點註射感染小鼠的視皮層區（V1），結果顯示HMEJ介導的在成體非分裂的成熟神經元中靶向整合效率可以達到50%左右（圖E F）。最後，研究者對HMEJ介導的基因靶向整合的機制進行瞭探討（圖G）。
該工作建立瞭一種新的基於HMEJ的靶向精確整合策略，即利用帶有單個向導RNA（sgRNA）靶向位點和長同源臂（約800bp）的供體載體來實現高效的精確整合。HMEJ介導的基因敲入方法擁有更高效的編輯效率和更好的精確度，為包括基因編輯動物模型的建立和疾病的靶向基因治療等應用提供瞭非常大的前景。
該項工作由博士研究生姚璇、王興、劉真與研究實習員胡新德在靈長類疾病模型研究組研究員楊輝、基因編輯平臺主任施霖宇與蘇州非人靈長類研究平臺主任孫強的指導下完成，課題組的其他成員積極參與，並得到瞭神經所研究員程樂平、上海科技大學研究員黃鵬羽的大力協助，是眾多課題組通力合作的重要成果。該工作得到中科院戰略性先導科技專項(XDB02050007 XDA01010409)，國傢高科技研發項目(863項目;2015AA020307)，國傢自然科學基金會(國傢自然科學基金委資助號31522037和31500825)，中國青年千人計劃(楊輝)，中科院重大突破項目、國傢關鍵技術研發項目(2014BAI03B00孫強)，上海市科學技術委員會項目(16JC1420202楊輝; 14140900100孫強)，中科院百人計劃(孫強)等項目的資助。
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